TIANSeq RNA Frag/cDNA ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಮಾಡ್ಯೂಲ್

ಪ್ರಸ್ತುತ, ಉನ್ನತ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವು ಮುಂದಿನ ಪೀಳಿಗೆಯ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ. ಮುಂದಿನ ಪೀಳಿಗೆಯ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದ ಓದುವ ಅವಧಿಯು ಸೀಮಿತವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ನಾವು ಪೂರ್ಣ ಉದ್ದದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕು ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಾಗಿ ವಿಭಜಿಸಬೇಕು. ವಿಭಿನ್ನ ಅನುಕ್ರಮ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಅಗತ್ಯತೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಏಕ-ಅಂತ್ಯದ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ಎಂಡ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಪ್ರಸ್ತುತ ಮುಂದಿನ ಪೀಳಿಗೆಯ ಅನುಕ್ರಮ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ DNA ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 200-800 bp ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಎ) ಡಿಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಕಳಪೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಕಿಣ್ವ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.

b) DNA ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ಪಿಸಿಆರ್ ಮುಕ್ತ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾದರಿಯ ಪ್ರಮಾಣವು ಸಾಕಷ್ಟಿಲ್ಲ. ವಿಭಜಿತ ಡಿಎನ್ಎಯ ಒಳಹರಿವು 50 ng ಅನ್ನು ಮೀರಿದಾಗ, ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಪಿಸಿಆರ್ ರಹಿತ ಕೆಲಸದ ಹರಿವನ್ನು ಆಯ್ದವಾಗಿ ಕೈಗೊಳ್ಳಬಹುದು. ಲೈಬ್ರರಿಯ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯು ನೇರವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗದಿದ್ದರೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್‌ನಿಂದ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಬಂಧನದ ನಂತರ ವರ್ಧಿಸಬಹುದು.

ಸಿ) ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವು ನಿಖರವಲ್ಲದ ಆರಂಭಿಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರಬಹುದು, ಇದು ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನಿಖರ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಮತ್ತು ಸಾಕಷ್ಟು ಡಿಎನ್ಎ ಲೋಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. RNase ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡುವ ಮೂಲಕ RNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದು.

ಎ -1

ಎ) ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳು (60 ಬಿಪಿ -120 ಬಿಪಿ) ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ತುಣುಕುಗಳು ಅಥವಾ ಅಡಾಪ್ಟರುಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ ಡೈಮರ್‌ಗಳು. Agencourt AMPure XP ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಶುದ್ಧೀಕರಣವು ಈ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದು ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.

b) ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ನಂತರ ಗ್ರಂಥಾಲಯದಲ್ಲಿ ದೊಡ್ಡ ತುಣುಕುಗಳು ಗೋಚರಿಸುತ್ತವೆ, ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಲಿಗೇಟ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಗ್ರಂಥಾಲಯ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕಿನ ಗಾತ್ರವು 120 ಬಿಪಿ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ. ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಬಂಧನದ ನಂತರ ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಣುಕು 120 ಬಿಪಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಇದು ಅತಿಯಾದ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ಅಸಹಜ ತುಣುಕಿನ ವರ್ಧನೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗಬಹುದು. ಪಿಸಿಆರ್ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು.

ಸಿ) ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಬಂಧನದ ನಂತರ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕುಗಳ ಅಸಹಜ ಗಾತ್ರ ಈ ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಡಾಪ್ಟರ್‌ನ ಉದ್ದವು 60 ಬಿಪಿ. ತುಣುಕಿನ ಎರಡು ತುದಿಗಳನ್ನು ಅಡಾಪ್ಟರುಗಳಿಗೆ ಜೋಡಿಸಿದಾಗ, ಉದ್ದವು ಕೇವಲ 120 bp ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಕಿಟ್ ಒದಗಿಸಿದ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಉದ್ದದಂತಹ ಸಂಬಂಧಿತ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಪೂರೈಕೆದಾರರನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ. ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಕೆಲಸದ ಹರಿವು ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯು ಕೈಪಿಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಹಂತಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸುವುದನ್ನು ದಯವಿಟ್ಟು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.

ಡಿ) ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಬಂಧನಕ್ಕೆ ಮುಂಚೆ ಅಸಹಜ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕು ಗಾತ್ರ ಡಿಎನ್ಎ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತಪ್ಪು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದ ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿರಬಹುದು. ವಿಭಿನ್ನ ಡಿಎನ್ಎ ಇನ್ಪುಟ್ಗಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸಮಯವನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು. ಡಿಎನ್ಎ ಇನ್ಪುಟ್ 10 ng ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಆರಂಭದ ಸಮಯವಾಗಿ 12 ನಿಮಿಷದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ತುಣುಕು ಗಾತ್ರವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ 300-500 bp ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ. ಬಳಕೆದಾರರು ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಣುಕುಗಳ ಉದ್ದವನ್ನು 2-4 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತಮ್ಮ ಸ್ವಂತ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಅಗತ್ಯ ಗಾತ್ರದೊಂದಿಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು.

ಎ -2

ಎ) ವಿಘಟನೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿಸದಿದ್ದರೆ ತುಂಡಾದ ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ತುಂಬಾ ದೊಡ್ಡದಾಗಿದ್ದರೆ, ದಯವಿಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಸೂಚನೆಯಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾದ ವಿಘಟನೆ ಸಮಯದ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳನ್ನು ನೋಡಿ, ಮತ್ತು ಈ ಸಮಯ ಬಿಂದುವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಿ, ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ ಸ್ಥಾಪಿಸಿ ವಿಘಟನೆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ನಿಖರವಾದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮಾಡಲು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು 3 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು.

ಎ -3

ವಿಘಟನೆಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಡಿಎನ್ಎಯ ಅಸಹಜ ಗಾತ್ರದ ವಿತರಣೆ

ಎ) ವಿಘಟನೆಯ ಕಾರಕದ ತಪ್ಪಾದ ಕರಗಿಸುವ ವಿಧಾನ, ಅಥವಾ ಕರಗಿದ ನಂತರ ಕಾರಕವು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ. 5 × ವಿಘಟನೆ ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ. ಕರಗಿದ ನಂತರ, ಕೊಳವೆಯ ಕೆಳಭಾಗವನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಫ್ಲಿಕ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಕಾರಕವನ್ನು ಸಮವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ. ಕಾರಕವನ್ನು ಸುಳಿಯಬೇಡಿ!

ಬಿ) ಡಿಎನ್ಎ ಇನ್ಪುಟ್ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಇಡಿಟಿಎ ಅಥವಾ ಇತರ ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕಗಳು ಉಪ್ಪು ಅಯಾನುಗಳ ಸವಕಳಿ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಚೆಲೇಟಿಂಗ್ ಏಜೆಂಟ್ ಗಳು ಪ್ರಯೋಗದ ಯಶಸ್ಸಿಗೆ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ. 1 × TE ಯಲ್ಲಿ DNA ಕರಗಿದ್ದರೆ, ತುಣುಕನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸೂಚನೆಯಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಿದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ. ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಇಡಿಟಿಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಅನಿಶ್ಚಿತವಾಗಿದ್ದರೆ, ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಸಿ) ನಿಖರವಲ್ಲದ ಆರಂಭಿಕ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪರಿಮಾಣ ವಿಭಜನೆಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಮೊದಲು, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎಯ ನಿಖರವಾದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಕುಬಿಟ್, ಪಿಕೋಗ್ರೀನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡಿಎನ್ಎಯ ನಿಖರವಾದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಅತ್ಯಗತ್ಯ.

 ಡಿ) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ತಯಾರಿಕೆಯು ಸೂಚನೆಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ವಿಭಜಿತ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ತಯಾರಿಕೆಯು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ನಡೆಸಬೇಕು. ಉತ್ತಮ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಇಡಬೇಕು ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ತಂಪಾಗಿಸಿದ ನಂತರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ತಯಾರಿಸಬೇಕು. ಸಿದ್ಧತೆ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ದಯವಿಟ್ಟು ಫ್ಲಿಕ್ ಅಥವಾ ಪೈಪೆಟ್ ಮಾಡಿ. ಸುಳಿಯಬೇಡಿ!

1. ತಪ್ಪಾದ ಮಿಶ್ರಣ ವಿಧಾನ (ಸುಳಿ, ಹಿಂಸಾತ್ಮಕ ಆಂದೋಲನ, ಇತ್ಯಾದಿ) ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ತುಣುಕುಗಳ ಅಸಹಜ ವಿತರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ), ಹೀಗಾಗಿ ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಫ್ರಾಗ್ಮೆಂಟೇಶನ್ ಮಿಕ್ಸ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ತಯಾರಿಸುವಾಗ, ದಯವಿಟ್ಟು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ಮೇಲಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಳಕ್ಕೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಪೈಪೆಟ್ ಮಾಡಿ, ಅಥವಾ ಬೆರಳ ತುದಿಯನ್ನು ಫ್ಲಿಕ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಸಮವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ. ಸುಳಿಯೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಯದಂತೆ ಎಚ್ಚರಿಕೆ ವಹಿಸಿ.

2. ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಶುದ್ಧತೆಯ ಡಿಎನ್ ಎ ಬಳಸಬೇಕು

DNA ಉತ್ತಮ ಡಿಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆ: ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ 30 ಕೆಬಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು, ಬಾಲವಿಲ್ಲದೆ

D OD260/230:> 1.5

D OD260/280: 1.7-1.9

3. ಡಿಎನ್‌ಎ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಪ್ರಮಾಣವು ನಿಖರವಾಗಿರಬೇಕು. ನ್ಯಾನೋಡ್ರಾಪ್‌ಗಿಂತ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಕ್ಯುಬಿಟ್ ಮತ್ತು ಪಿಕೊಗ್ರೀನ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ.

4. ಡಿಎನ್ಎ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಇಡಿಟಿಎಯ ವಿಷಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕು ಇಡಿಟಿಎ ವಿಘಟನೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ. EDTA ಯ ವಿಷಯವು ಅಧಿಕವಾಗಿದ್ದರೆ, ನಂತರದ ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಮೊದಲು DNA ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ಮಾಡಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ.

5. ವಿಭಜನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ತಯಾರಿಸಬೇಕು ವಿಘಟನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಮಯಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ವಿಶೇಷವಾಗಿ ವರ್ಧಕವನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ). ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದ ನಿಖರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ದಯವಿಟ್ಟು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ.

6. ವಿಭಜನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯವು ನಿಖರವಾಗಿರಬೇಕು ವಿಘಟನೆಯ ಹಂತದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯವು ನೇರವಾಗಿ ತುಣುಕು ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಗಾತ್ರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ, ಹೀಗಾಗಿ ಗ್ರಂಥಾಲಯದಲ್ಲಿ DNA ತುಣುಕುಗಳ ಗಾತ್ರ ವಿತರಣೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.

1. ಈ ಕಿಟ್‌ಗೆ ಯಾವ ರೀತಿಯ ಮಾದರಿ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ?

ಈ ಕಿಟ್‌ನ ಅನ್ವಯವಾಗುವ ಮಾದರಿ ಪ್ರಕಾರವು ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅಥವಾ ಉತ್ತಮ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಎಮ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಆಗಿರಬಹುದು. ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬಳಸಿದರೆ, ಮೊದಲು ಆರ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ತೆಗೆಯಲು ಆರ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಡಿಪ್ಲೆಶನ್ ಕಿಟ್ (ಕ್ಯಾಟ್#4992363/4992364/4992391) ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

2. ಈ ಕಿಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಗ್ರಂಥಾಲಯವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು FFPE ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದೇ?

ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಪಿಇ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಎಮ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ ಕೆಳಮಟ್ಟಕ್ಕಿಳಿಯುತ್ತದೆ, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಕಳಪೆ ಸಮಗ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ. ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣಕ್ಕಾಗಿ ಈ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, ವಿಘಟನೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ವಿಘಟನೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ ಅಥವಾ ವಿಘಟನೆಯನ್ನು ಮಾಡಬೇಡಿ).

3. ಉತ್ಪನ್ನ ಕೈಪಿಡಿಯಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾದ ಗಾತ್ರದ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಸೇರಿಸಿದ ವಿಭಾಗವು ಸ್ವಲ್ಪ ವಿಚಲನವನ್ನು ಕಾಣಲು ಏನು ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು?

ಗಾತ್ರದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಈ ಉತ್ಪನ್ನ ಕೈಪಿಡಿಯಲ್ಲಿನ ಗಾತ್ರದ ಆಯ್ಕೆ ಹಂತಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಕೈಗೊಳ್ಳಬೇಕು. ವಿಚಲನವಿದ್ದಲ್ಲಿ, ಆಯಸ್ಕಾಂತೀಯ ಮಣಿಗಳು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ಸಮತೋಲಿತವಾಗಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣವಾಗದಿರಬಹುದು, ಪೈಪೆಟ್ ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ದ್ರವವು ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಉಳಿಯುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಲಹೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

4. ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣದಲ್ಲಿ ಅಡಾಪ್ಟರುಗಳ ಆಯ್ಕೆ

ಗ್ರಂಥಾಲಯ ನಿರ್ಮಾಣ ಕಿಟ್ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಕಾರಕವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಈ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು TIANSeq ಸಿಂಗಲ್-ಇಂಡೆಕ್ಸ್ ಅಡಾಪ್ಟರ್ (ಇಲ್ಯುಮಿನಾ) (4992641/4992642/4992378) ಜೊತೆಗೆ ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.

5. ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಕ್ಯೂಸಿ

ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪತ್ತೆ: ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಸಮೂಹ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಮೋಲಾರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಕ್ಯುಬಿಟ್ ಮತ್ತು ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಉತ್ಪನ್ನ ಕೈಪಿಡಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ NGS ಅನುಕ್ರಮದ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸುತ್ತದೆ. ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವಿತರಣಾ ಶ್ರೇಣಿಯ ಪತ್ತೆ: ಗ್ರಂಥಾಲಯ ವಿತರಣಾ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಬಯೋಅನಲೈಜರ್ ಬಳಸಿ.

6. ವರ್ಧನೆಯ ಚಕ್ರ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಆಯ್ಕೆ

ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಸೈಕಲ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ 6-12, ಮತ್ತು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪಿಸಿಆರ್ ಸೈಕಲ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಮಾದರಿ ಇನ್ಪುಟ್‌ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬೇಕು. ಅಧಿಕ ಇಳುವರಿ ನೀಡುವ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳಲ್ಲಿ, ಅಧಿಕ ವರ್ಧನೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವಿವಿಧ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಗುರಿಯ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯ ಉತ್ತುಂಗದ 2100 ಬಯೋಅನಲೈಜರ್ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ನಂತರ ಸ್ವಲ್ಪ ದೊಡ್ಡ ಶಿಖರದಿಂದ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಕ್ಯೂಬಿಟಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು qPCR ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಸೌಮ್ಯವಾದ ವರ್ಧನೆಯು ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿದ್ಯಮಾನವಾಗಿದೆ, ಇದು ಗ್ರಂಥಾಲಯದ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ನಂತರದ ದತ್ತಾಂಶ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ.

7. ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಬಯೋಅನಲೈಜರ್‌ನ ಪತ್ತೆ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪೈಕ್‌ಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ

ಎಜಿಲೆಂಟ್ 2100 ಬಯೋಅನಲೈಜರ್ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಪೈಕ್‌ಗಳ ಗೋಚರಿಸುವಿಕೆಯು ಮಾದರಿಗಳ ಅಸಮ ವಿಘಟನೆಯಿಂದಾಗಿ, ಅಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ತುಣುಕುಗಳು ಇರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ನಂತರ ಇದು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಗಾತ್ರದ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಮಾಡಬಾರದೆಂದು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ, ಅಂದರೆ ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು 94 ° C ಗೆ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇಂಕ್ಯುಬೇಟೆಡ್ ಆಗಿ ಹೊಂದಿಸಿ, ಅಲ್ಲಿ ತುಣುಕು ವಿತರಣೆ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಏಕರೂಪತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.