ಫಾಸ್ಟ್ ಕಿಂಗ್ ಒನ್ ಸ್ಟೆಪ್ ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್

A-1 RNA ಅನ್ನು ಕೆಳಮಟ್ಟಕ್ಕಿಳಿಸಲಾಗಿದೆ

—— ಯಾವುದೇ ಮಾಲಿನ್ಯವಿಲ್ಲದೆ ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿ. ಆರ್ಎನ್ಎ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ವಸ್ತುವು ಆರ್ಎನ್ಎ ಅವನತಿಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ತಾಜಾವಾಗಿರಬೇಕು. ಆರ್ಟಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲು ಡಿನೇಚರ್ ಜೆಲ್ ಮೇಲೆ ಆರ್ಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿ. ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆದ ನಂತರ, ಅದನ್ನು 100% ಫಾರ್ಮಾಮೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು. RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಬಿಸಿ ತಾಪಮಾನವು <45 ° C ಆಗಿರಬೇಕು ಮತ್ತು pH 8.0 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇರಬೇಕು, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಪ್ರತಿಬಂಧಕವು ಎಲ್ಲಾ ಬಂಧಿತ RNase ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, N 0.8 mM DTT ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣಗಳಲ್ಲಿ RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕವನ್ನು ಸೇರಿಸಬೇಕು.

A-2 RNA ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ

--- ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ಗಳು SDS, EDTA, ಗ್ಲಿಸರಾಲ್, ಸೋಡಿಯಂ ಪೈರೊಫಾಸ್ಫೇಟ್, ಸ್ಪರ್ಮಿಡಿನ್, ಫಾರ್ಮಾಮೈಡ್, ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಉಪ್ಪು, ಇತ್ಯಾದಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತವೆ. ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು 70% (v/v) ಎಥೆನಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ RNA ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ.

ಎ -3 ಸಿಡಿಎನ್ಎಯ ಮೊದಲ ಎಳೆಯನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಬಳಸುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸಾಕಷ್ಟು ಅನೀಲಿಂಗ್

—— ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಬಳಸುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ಸೂಕ್ತವೆಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಿ. ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಹೆಕ್ಸಾಮರ್‌ಗಳಿಗೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವ ಮೊದಲು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 25 ° C ತಾಪಮಾನವನ್ನು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ (ಜಿಎಸ್‌ಪಿ), ಇತರ ಜಿಎಸ್‌ಪಿಯನ್ನು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ, ಅಥವಾ ಒಲಿಗೋ (ಡಿಟಿ) ಅಥವಾ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಹೆಕ್ಸಾಮರ್‌ಗೆ ಬದಲಿಸಿ.

A-4 ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ RNA ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ

—— RNA ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ. 50 ng ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ RNA ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, 0.1 μg ನಿಂದ 0.5 μg ಅಸಿಟೈಲ್ BSA ಅನ್ನು ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಬಹುದು

ಎ -5 ವಿಶ್ಲೇಷಿತ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.

—— ಇತರ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿ.

ಎ -6 ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವಿಫಲವಾಗಿದೆ

—— ಎರಡು ಹಂತದ RT-PCR ಗಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣದ 1/5 ಮೀರಬಾರದು.

A-1 ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಅನೆಲಿಂಗ್

—— 3'- ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅಂತ್ಯವು 2-3 ಡಿಜಿ ಅಥವಾ ಡಿಸಿ ಹೊಂದಿರಬಾರದು. ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಆಲಿಗೋ (ಡಿಟಿ) ಬದಲಿಗೆ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಮೊದಲ ಕೆಲವು ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ, ತದನಂತರ ಕಡಿಮೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಾಗಿ ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಬಳಸಿ.

A-2 ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಕಳಪೆ ವಿನ್ಯಾಸ

—— ವರ್ಧಕ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸಕ್ಕಾಗಿ ಅದೇ ತತ್ವಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ.

A-3 RNA ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಯಿಂದ ಕಲುಷಿತಗೊಂಡಿದೆ

—— PCR- ದರ್ಜೆಯ DNase I ಜೊತೆಗೆ RNA ಚಿಕಿತ್ಸೆ

ಎ -4 ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ರೂಪಿಸುವುದು

—— 3 'ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಲ್ಲದೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿ.

ಎ -5 ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಎಂಜಿ²⁺ ಏಕಾಗ್ರತೆ

—— Mg ಅನ್ನು ಆಪ್ಟಿಮೈಸ್ ಮಾಡಿ²⁺ ಪ್ರತಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಸಂಯೋಜನೆಗೆ ಏಕಾಗ್ರತೆ

A-6 ವಿದೇಶಿ DNA ಯಿಂದ ಕಲುಷಿತಗೊಂಡಿದೆ

—— ಏರೋಸಾಲ್-ನಿರೋಧಕ ಸಲಹೆಗಳು ಮತ್ತು UDG ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.

A-1 ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಉತ್ಪನ್ನದ ವಿಷಯವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ

—— ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಉತ್ಪನ್ನದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ.

ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಎ -2 ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೈಮರ್ ಮೊತ್ತ

—— ಪ್ರೈಮರ್ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ.

ಎ -3 ಹಲವು ಚಕ್ರಗಳು

—— ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಸೈಕಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ.

ಎ -4 ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ

—— ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಆರಂಭ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.

ಎ -5 ಡಿಎನ್ಎ ಡಿಎನ್‍ಎಸ್ ಅವನತಿಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಒಲಿಗೊನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ತುಣುಕುಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆ- ಡಿಎನ್‌ಎ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ.

ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ರಿವರ್ಸ್‌ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರೈಬ್ ಮಾಡುವುದು, ತದನಂತರ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರೈಬ್ಡ್ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಗುರಿ ತುಣುಕನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಬಳಸುವುದು. ಪ್ರಯೋಗದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ ಮತ್ತು ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆರಿಸಿ. ಮೇಲಿನ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಯಿಲ್ಲದೆ ಸಣ್ಣ ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟಿಕ್ ಸೆಲ್ ಎಮ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.

ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್: ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ದೀರ್ಘವಾದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ, ಹಾಗೆಯೇ ಆರ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಎಮ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಟಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮುಂತಾದ ಎಲ್ಲ ರೀತಿಯ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿವೆ. ಇವುಗಳನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಒಂದೇ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಆರ್‌ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ: ಪಾಲಿಎ ಟೈಲಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ (ಪ್ರೊಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ, ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ ಆರ್‌ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ಟಿಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ ಪಾಲಿಎ ಬಾಲಗಳಿಲ್ಲ). ಒಲಿಗೊ ಡಿಟಿ ಪಾಲಿಎ ಬಾಲಕ್ಕೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟವು ಅಧಿಕವಾಗಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಅವನತಿ ಕೂಡ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಬಹಳವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.

ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್: ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ, ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮವು ತಿಳಿದಿರುವ ಸಂದರ್ಭಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.

ಎರಡು ಮಾರ್ಗಗಳಿವೆ:

1. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ವಿಧಾನ: ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿ, ಸಿಡಿಎನ್ಎ ವಿಭಿನ್ನ ಉದ್ದಗಳ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕುಗಳು, ಆದ್ದರಿಂದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಫಲಿತಾಂಶವು ಸ್ಮೀಯರ್ ಆಗಿದೆ. ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮೃದ್ಧಿಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದ್ದರೆ, ಯಾವುದೇ ಉತ್ಪನ್ನವು ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಇದರರ್ಥ ಯಾವುದೇ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್‌ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದಲ್ಲ. ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಪತ್ತೆ ಮಾಡಲು ಬಳಸಬಹುದು. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ಖಾತರಿಪಡಿಸಬಹುದು (ಕೆಲವು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಉದ್ದೇಶಿತ ಜೀನ್ ತುಣುಕು ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾಗಿದ್ದರೆ, ವಿನಾಯಿತಿಗಳು ಇರಬಹುದು).

2. ಈ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಒಂದು ಗೊತ್ತಿರುವ ಜೀನ್ ಇದ್ದರೆ, ಅದನ್ನು ಈ ವಂಶವಾಹಿಯ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ವರ್ಧನೆಯು ಸಿಡಿಎನ್ಎಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲ ಎಂದು ಅರ್ಥವಲ್ಲ. ಸಿಡಿಎನ್ಎಯಲ್ಲಿ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ, ಅದನ್ನು ವರ್ಧಿಸುವುದು ಸುಲಭ. ಸಂಭವನೀಯತೆಯ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದಿಂದ ಸಿಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ವಿವಿಧ ಕಾರಣಗಳಿಗಾಗಿ ಭಾಗಶಃ ಕುಗ್ಗಿಸಿದರೆ, ಕಡಿಮೆ ಸಮೃದ್ಧಿಯ ಗುರಿ ವಂಶವಾಹಿಗಳ ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವು ಇನ್ನೂ ಹೇರಳವಾಗಿದ್ದರೂ, ವರ್ಧನೆಯು ಬಹುಶಃ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ.

ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಭಾಗಶಃ ಅವನತಿ. ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿ

ವಿಭಿನ್ನ ಜಾತಿಗಳ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ವಿಷಯಗಳು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು, ಆದರೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಸ್ಪಷ್ಟ 28 ಎಸ್ ಮತ್ತು 18 ಎಸ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಹಿಂದಿನ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನ ಹೊಳಪು ಎರಡನೆಯದಕ್ಕಿಂತ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿರಬೇಕು. 5 ಎಸ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಕುಸಿಯಿತು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಅದರ ಹೊಳಪು ಅವನತಿಯ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ಯಶಸ್ವಿ ವರ್ಧನೆಯು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲ ಎಂದು ಅರ್ಥವಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ, ಅವನತಿ ತೀವ್ರವಾಗಿರದವರೆಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಬಹುದು. ಒಡಿ₂₆₀/ಒಡಿ₂₈₀ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್‌ನಿಂದ ಅಳೆಯಲಾದ ಶುದ್ಧ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನುಪಾತವು 1.9 ಮತ್ತು 2.1 ರ ನಡುವೆ ಇರಬೇಕು. ಆರ್ ಎನ್ ಎ ಯಲ್ಲಿ ಅಲ್ಪ ಪ್ರಮಾಣದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅಶುದ್ಧತೆಯು ಅನುಪಾತವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ ಮೌಲ್ಯವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲವೋ ಅಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ, ಆರ್ಟಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ. ಆರ್‌ಟಿಗೆ ಅತ್ಯಂತ ಮುಖ್ಯವಾದ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆ.

ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ವಂಶವಾಹಿಯ ವಿಸ್ತರಣೆಯು RT ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಮಾತ್ರ ಸೂಚಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ಇದು cDNA ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಗುಣಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಅಗತ್ಯವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿಲ್ಲ. ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದ ತುಣುಕುಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಅಧಿಕವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗುವುದು ಸುಲಭ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಉದ್ದೇಶಿತ ವಂಶವಾಹಿಯ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಜೀನ್ ನಿಂದ ಜೀನ್ ಗೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಕೇವಲ 2 ಕೆಬಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಉದ್ದದ ಗುರಿ ತುಣುಕುಗಳಿಗೆ ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖದಿಂದ ಮಾತ್ರ ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.

ಕೆಲವು ಮಾದರಿಗಳು ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಅಥವಾ ಶ್ರೀಮಂತ ಜಿಸಿ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಸಮೃದ್ಧಿಯೊಂದಿಗೆ ಅಮೂಲ್ಯವಾಗಿವೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಉದ್ದೇಶಿತ ತುಣುಕಿನ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ಮಾದರಿಯ ಪ್ರಕಾರ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬೇಕು. ಹೆಚ್ಚಿನ ಜಿಸಿ ವಿಷಯ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಸಾಮಾನ್ಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ತೆರೆಯುವುದು ಕಷ್ಟ. ಈ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ, ಕ್ವಾಂಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು, ಏಕೆಂದರೆ ಅದರ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ M-MLV ಸರಣಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್‌ಗಿಂತ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ, ಇದು ವಿವಿಧ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಸ್ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗೆ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ ಮಾಡಬಹುದು. ಸಾಮಾನ್ಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವಾಗ, 20 μl ಸಿಸ್ಟಮ್ ಕೇವಲ 1 μg ಒಟ್ಟು RNA ಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಮಾಡಬಹುದು. ಕಿಟ್‌ನ ಗರಿಷ್ಠ ಆರ್‌ಟಿ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕೆ ದಯವಿಟ್ಟು ಗಮನ ಕೊಡಿ. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಅಧಿಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸಿದರೆ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮೃದ್ಧಿಯೊಂದಿಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗೆ ಅನುಕೂಲವಾಗುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಗರಿಷ್ಠ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಮೀರದಿರುವುದು ಉತ್ತಮ.

ಎ -1 ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ತೀವ್ರವಾಗಿ ಕುಸಿದಿದೆಯೇ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಟಿ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ

ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ವರ್ಧನೆಯ ವೈಫಲ್ಯದ ಕಾರಣವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಗಂಭೀರ ಆರ್ಎನ್ಎ ಅವನತಿಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ. ಇನ್ನೊಂದು ಸಂಭವನೀಯ ಕಾರಣವೆಂದರೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ವೈಫಲ್ಯ. ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಿಂಗಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖವನ್ನು ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಸಮಸ್ಯೆ ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಇದನ್ನು ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು. ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಮುಖ್ಯವಾದ ವಿಷಯವೆಂದರೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ಸ್ಥಿರ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವುದು.

A-2 ಆಂತರಿಕ ಉಲ್ಲೇಖ ವಂಶವಾಹಿಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹವಾಗಿದೆಯೇ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಳಸುವ ಕಾರಕಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಮಸ್ಯೆಗಳಿವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ.

ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್‌ಗೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಬೇಕು, ಇದು ಅನೇಕ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಕಿಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಹ ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಇನ್ಪುಟ್ ಅನ್ನು 1 μg ಎಂದು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿ. ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಆರ್ಎನ್ಎ, ಆಲಿಗೋ ಡಿಟಿ, ಕಿಣ್ವ, ಡಿಎನ್ಟಿಪಿ, ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಡಿಎನ್ಎ ಅವಶೇಷಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಮಿಶ್ರ ಪರಿಹಾರವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ವಿಚಲನ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸಿಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸುವುದು ಅಸಾಧ್ಯ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ ಅಗತ್ಯ. ವಿಭಿನ್ನ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ದಕ್ಷತೆಯು ಒಂದೇ ಆಗಿರುವುದನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಪಡೆದ ಪ್ರಮಾಣವು ಒಂದೇ ಆಗಿರಬೇಕು ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಒಂದೇ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟಗಳ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ತುಲನಾತ್ಮಕ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವಾಗ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ನಂತರ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲದಿರಬಹುದು ಏಕೆಂದರೆ ಆಂತರಿಕ ರೆಫರೆನ್ಸ್ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ರೆಫರೆನ್ಸ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.

ಇದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ವಂಶವಾಹಿಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಉದ್ದನೆಯ ತುಣುಕಿನ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನವು ಹೆಚ್ಚಿನ ವಂಶವಾಹಿಗಳಿಗೆ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಲ್ಲ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್‌ನ ದಕ್ಷತೆಯು ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ. ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, ಜಿಸಿ ಸಮೃದ್ಧ ಪ್ರದೇಶ ಮತ್ತು ಅನೇಕ ವಂಶವಾಹಿಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಎರಡನ್ನೂ ನಿರ್ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ನಿಷ್ಠೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಒಂದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಖಾತರಿಪಡಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ. ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ಕಡಿಮೆ ನಕಲು ವಂಶವಾಹಿಗಳಿಗೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಆಲಿಗೋ ಡಿಟಿ ಬಳಸಿ ದೀರ್ಘ ತುಣುಕನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಯಾರೂ ಖಾತರಿ ನೀಡಲಾರರು. ಹೆಚ್ಚು GC ಯೊಂದಿಗೆ 5 'UTR ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ, ಇದು ಇನ್ನಷ್ಟು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಅನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಮಾಡುವುದು, ಉದ್ದೇಶಿತ ತುಣುಕಿನಲ್ಲಿ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಸೀಳು ಸ್ಥಳಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವುದು, ವಿಭಾಗಗಳ ಮೂಲಕ ವರ್ಧಿಸುವುದು ಮತ್ತು ನಂತರ ನಿರ್ಬಂಧ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಬಂಧನವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವುದು ಇನ್ನೂ ಸಮಂಜಸವಾದ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, 2 kb ಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾದ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ವರ್ಧಿಸುವುದು ಕಷ್ಟ, ಆದರೆ ಅದನ್ನು ಪಡೆಯುವುದು ಯಾವಾಗಲೂ ಅಸಾಧ್ಯವಲ್ಲ: 1. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, RNA/mRNA ಯ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಖಾತರಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು TRIZOL ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಆದ್ಯತೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ. 2.M-MLV RT-PCR ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು. ಅನೆಲಿಂಗ್ ಸಮಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಿ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಸೈಕಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ. ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ, ಗೂಡುಕಟ್ಟಿದ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು, ಅಥವಾ ಸಾಮಾನ್ಯ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ವಿಸ್ತರಿಸಿದ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ಮೊದಲು ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಬಹುದು, ಇದು ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ನ ನಿಷ್ಠೆಗೆ ಗಮನ ಕೊಡಿ. 3. ಪಿಸಿಆರ್ ನಲ್ಲಿ ಲಾಂಗ್ ಟಾಕ್ ಅನ್ನು ಆದರ್ಶ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಬಳಸಬಹುದು. 4. ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಅನ್ವಯಕ್ಕಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಷ್ಠೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಬೇಕು.

TIANGEN ನೀಡುವ ಎರಡು ರೀತಿಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ಗಳಿವೆ: ಕ್ವಾಂಟ್/ಕಿಂಗ್ RTase ಮತ್ತು TIANScript M-MLV. ಅವುಗಳ ನಡುವಿನ ಮುಖ್ಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸವೆಂದರೆ ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್ಗಳ ಇನ್ಪುಟ್ ಪ್ರಮಾಣ. ಕ್ವಾಂಟ್ ಒಂದು ಅನನ್ಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಮೊಲೊನಿ ಮುರೈನ್ ಲ್ಯುಕೇಮಿಯಾ ವೈರಸ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ M-MLV ಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. ಕ್ವಾಂಟ್ ಒಂದು ಹೊಸ ಉನ್ನತ-ದಕ್ಷತೆಯ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಆಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಎಸ್ಚೆರಿಚಿಯಾ ಕೋಲಿಯಿಂದ ಪುನಃ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕ್ವಾಂಟ್ 50 ng-2 Rg RNA ಯ ಅಧಿಕ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಶನಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಇಳುವರಿಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಧಿಸಲು ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ MMLV ಅಥವಾ AMV ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಕ್ವಾಂಟ್‌ನ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಗುಣಲಕ್ಷಣವೆಂದರೆ ಅದು RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಬಲವಾದ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಇಲ್ಲದೆ ರಿವರ್ಸ್ ಮಾಡಬಹುದು. ಹೆಚ್ಚಿನ ಜಿಸಿ ವಿಷಯ ಹೊಂದಿರುವ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, ರಿವರ್ಸ್ ದಕ್ಷತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು cDNA ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು (<4.5 kb ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ). ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನಕ್ಕಾಗಿ, TIANScript MMLV ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಈ ಆರ್‌ಟೇಸ್ ಅತ್ಯಂತ ದುರ್ಬಲ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಸ್ ಎಚ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಕಿಣ್ವವಾಗಿದೆ, ಇದು ದೀರ್ಘ (> 5 ಕೆಬಿ) ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.

ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ನಡುವಿನ ಟ್ಯೂಬ್ ಕವರ್ ತೆರೆಯದೆ ಒಂದೇ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಂದು ಹಂತದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯು ಪೂರ್ಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಇದು ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಪಡೆದ ಎಲ್ಲಾ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವರ್ಧನೆಗೆ ಬಳಸುವುದರಿಂದ, ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು ಹೆಚ್ಚಿರುತ್ತದೆ, ಒಟ್ಟು ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಕನಿಷ್ಠ 0.01 ಪಿಜಿ. ಯಶಸ್ವಿ ಒಂದು ಹಂತದ RTPCR ಗಾಗಿ, ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಆರಂಭಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎರಡು ಹಂತದ ವಿಧಾನ, ಅಂದರೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಎರಡು ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೊದಲಿಗೆ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಪಡೆಯಲು ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನಿಂದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪಡೆದ ಸಿಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಒಂದು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚು ವಿಭಿನ್ನ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎರಡು ಹಂತದ ವಿಧಾನವು ಒಲಿಗೊ (ಡಿಟಿ) ಅಥವಾ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನ ನೀಡಲು ಬಳಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಎಲ್ಲಾ ಎಂಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಮಾಡಬಹುದು.